I sensori di voltaggio geneticamente codificati sono strumenti raffinati per lo studio dei potenziali di membrana di tutte le cellule. Negli ultimi anni questi indicatori hanno raggiunto altissimi livelli di qualità riuscendo a registrare le attività neuronali con elevata risoluzione temporale (ordine dei millisecondi). Tra i più utilizzati troviamo il celebre plasmide JEDI-2P, il quale, oltre ad un nome stuzzicante per i fan dei film di fantascienza, offre prestazioni eccellenti rispetto ai suoi predecessori. Tuttavia, la cinetica ultraveloce e l’elevata fedeltà non è sufficiente per rilevare con precisione segnali di voltaggio in vivo e in vitro. Infatti, una delle sfide significative nell’acquisizione di dinamiche ultrarapide è la mancanza di attrezzature sufficientemente veloci. Fino a pochi anni fa, c’è stata una carenza di strumenti in grado di acquisire immagini a velocità superiori ai kHz, dunque attorno allo standard elettrofisiologico di 10kHz. A colmare questa lacuna tecnologica ci ha pensato Femtonics con il suo microscopio FEMTO 3D ATLAS. Questo microscopio 2 fotoni si distingue dai microscopi 2 fotoni convenzionali grazie alla sua tecnologia unica: l’Acousto-Optic technology. Attraverso questo approccio innovativo, FEMTO 3D ATLAS è in grado di acquisire regioni 3D ad altissima frequenza, consentendo la registrazione efficace di più aree sia in vivo che in vitro. A contribuire enormemente alla qualità del segnale acquisito, non è solamente la tecnologia di acquisizione: FEMTO 3D ATLAS è equipaggiato con FocusPinner, il primo sistema di Real Time Motion Correction in grado di stabilizzare l’immagine in X, Y e pure Z. Questo modulo di correzione del movimento garantisce un elevato rapporto Segnale-Rumore (SNR) e dunque un’elevata qualità d’immagine e drastica riduzione di artefatti.
Figura 1: A. Misurazioni di Voltage e Calcium signaling in un esperimento di whole-cell patch clamp su sezione di cervello marcata con JEDI-2P (Voltage Sensor – Rosso) e jRGECO (Calcium Sensor – Verde). In blu sono rappresentati i potenziali d’azione evocati (patch clamp), mentre in rosso e verde i segnali registrati. Mentre le dinamiche del potenziale d’azione si aggirano sull’ordine dei millisecondi, quelle del calcio sono più lente. B. Per registrare potenziali d’azione in maniera adeguata è dunque necessario utilizzare microscopi con alta frequenza di acquisizione come FEMTO 3D ATLAS. Infatti, lo stesso segnale misurato a 8400Hz, perde notevolmente di qualità se acquisito a frequenze inferiori (40Hz e 21Hz).
A riprova di quanto affermato, in figura 1 è possibile osservare delle registrazioni di Voltage e Calcium signaling effettuate con FEMTO 3D ATLAS. Nello specifico, i segnali rappresentati provengono da un esperimento di whole-cell patch clamp su sezione di cervello marcata con JEDI-2P e jRGECO. Dalla figura è possibile notare l’andamento dei segnali di voltaggio e calcio in risposta ai potenziali d’azione evocati. È evidente come, rispetto al segnale di calcio, i picchi di potenziale d’azione siano caratterizzati da dinamiche nettamente più rapide: mentre per le dinamiche del calcio possono essere sufficienti registrazioni a 30Hz, il voltaggio necessita di registrazioni sull’ordine dei kHz. Pertanto l’utilizzo di FEMTO 3D ATLAS diventa essenziale per ottenere acquisizioni affidabili di questi segnali. Nella seconda parte della figura 1 (Figura 1B) infatti, è possibile notare come la risoluzione temporale di FEMTO 3D ATLAS sia determinante: lo stesso segnale di voltaggio registrato a 8400Hz, peggiora significativamente quando acquisito a 40Hz e 21Hz.