Uno dei vantaggi più significativi della microscopia a 2 fotoni è la capacità di visualizzare non solo la superficie dei tessuti in vivo, ma anche i loro strati più profondi. Ma nello specifico, quanto in profondità possiamo effettivamente arrivare con un microscopio a 2 fotoni?
La risposta dipende da numerosi parametri esterni, tra cui la lunghezza d’onda e il tipo del laser, la qualità dello staining, il tipo di tessuto, la qualità della preparazione, ecc.. Per cercare di dare una risposta quanto più precisa a questa domanda, in questo articolo analizzeremo il potere penetrante di FEMTO 3D ATLAS durante un esperimento impegnativo come il Calcium imaging in vivo degli strati profondi della corteccia cerebrale e dell’ippocampo.
FEMTO 3D ATLAS è un microscopio a 2 fotoni che utilizza una tecnologia di acquisizione unica: l’Acousto Optic technology. Questo approccio innovativo consente l’acquisizione ultra-veloce di regioni tridimensionali, anche in strati profondi dei tessuti (per ulteriori approfondimenti, leggete il nostro precedente articolo dedicato: AcoustoOpticTechnology).
Oltre all’Acousto Optic technology, FEMTO 3D ATLAS è dotato di svariati elementi tecnici che contribuiscono al miglioramento del potere penetrante. Quando si tenta di visualizzare tessuti profondi, lo scattering (dispersione) dei fotoni diventa uno dei problemi principali e di conseguenza l’intensità dell’immagine cala drasticamente. Per risolvere questo limite tecnico è fondamentale ridurre il diametro del raggio laser, il quale ridurrà al minimo lo scattering e migliorerà la qualità dell’immagine a maggiori profondità (Figura 1).
Figura 1: Rappresentazione grafica dello scattering di un raggio laser attraverso obiettivi ad alta apertura numerica. Il raggio laser tende a disperdere fotoni prima di raggiungere il piano focale (a sinistra), ma l’effetto di scattering è ridotto se si riduce il diametro del raggio laser (a destra).
FEMTO 3D ATLAS consente il controllo diretto del diametro del raggio laser e, assieme a ulteriori sistemi di stabilizzazione del laser e dell’immagine (vedi articolo Femtonics Live Motion Correction), permette la penetrazione dei tessuti fino a 1mm senza perdita di potenza o qualità d’immagine. Attraverso l’applicazione di precise tecniche di colorazione, con FEMTO 3D ATLAS sarà possibile analizzare strutture cerebrali anche nei tessuti profondi. Utilizzando lunghezze d’onda maggiori si raggiungeranno profondità maggiori; inoltre, la miglior intensità di segnale ottenuta grazie all’ottimizzazione del laser si tradurrà in una miglior qualità d’immagine.
L’imaging dell’ippocampo costituisce un eccellente esempio per sottolineare il potenziale del DFI (Figura 2). Evitando danni ai tessuti, è possibile ottenere un rapporto segnale-rumore (SNR) più elevato, consentendo tempi di acquisizione più lunghi e una migliore risoluzione spaziale.
Figura 2: Esempio di Deep Functional Imaging con FEMTO 3D ATLAS. A sinistra acquisizione dell’attività di calcio in neocorteccia a 850um di profondità, mentre a destra attività di calcio in ippocampo (CA1 Pyr layer). In entrambi i casi, l’acquisizione è riportata con e senza DFI, ovvero tutte le ottimizzazioni e stabilizzazioni del laser messe in atto dai vari moduli di FEMTO 3D ATLAS. La qualità d’immagine migliora e anche in tessuti profondi è possibile effettuare registrazioni con un alto SNR e misurazioni affidabili.