Il cervello umano è costituito da miliardi di neuroni che comunicano tra loro attraverso le sinapsi, minuscoli punti di contatto dove avviene il rilascio di neurotrasmettitori. Questo intricato network neurale è alla base di ogni pensiero, memoria e comportamento, ma proprio la sua complessità lo rende estremamente difficile da studiare in modo diretto.
L’uncaging è una tecnica ottica avanzata che permette di rilasciare molecole bioattive con un controllo spaziale e temporale estremamente preciso. In neuroscienze si è affermata come uno strumento fondamentale per imitare il rilascio naturale di neurotrasmettitori come il glutammato. Grazie a questa tecnica è possibile stimolare in modo mirato dendriti, spine o persino singole sinapsi, per poi studiare direttamente la distribuzione dei recettori, la funzione sinaptica e i meccanismi di plasticità. In questo modo, l’uncaging apre delle nuove possibilità per lo studio dei processi che regolano l’attività cerebrale, contribuendo enormemente alla scoperta di questo complesso “universo”.
La tecnica dell’uncaging si realizza con impulsi di luce infrarossa ultraveloci (femtosecondi), pertanto lo strumento opportuno per questo approccio è il microscopio a 2 fotoni. Questa tipologia di sistemi utilizza laser con lunghezze d’onda nel campo dell’infrarosso, perfetti per stimolare le molecole “caged”, ma anche per effettuare imaging ad alta frequenza minimizzando i danni ai tessuti circostanti.
Un esempio di microscopio adatto all’uncaging è FEMTO SMART, microscopio a 2 fotoni di Femtonics, progettato per garantire la massima precisione e flessibilità negli esperimenti di neuroscienze avanzate. Le sue ottiche di altissima qualità, gli scanner galvanometrici e la configurazione con doppio percorso ottico, permettono sia imaging ad alta risoluzione che stimolazione ottica mirata. Questo setup consente di combinare in un unico setup la potenza del laser per la stimolazione con il percorso ottico già esistente per l’imaging. FEMTO SMART è in grado di passare dalla stimolazione all’acquisizione in pochi microsecondi, consentendo un’analisi praticamente simultanea della sinapsi e dell’attività neuronale
Figura 1: Esperimento di uncaging effettuato con FEMTO SMART con configurazione Galvo e modulo Multiple Beam Path. La stimolazione per l’uncaging del glutammato (punti gialli) e l’imaging a due fotoni (linee verdi) vengono applicati simultaneamente su dendriti e spine neuronali. L’attivazione locale provoca variazioni del calcio intracellulare (traccia arancione) e segnali elettrofisiologici (traccia blu), permettendo di correlare in tempo reale la stimolazione ottica con la risposta funzionale della cellula.
Un esempio di esperimento di uncaging è riportato in figura 1. In questo esperimento in vitro, è stato liberato previa stimolazione ottica il DNI-GLU-TFA, un composto prodotto da Femtonics costituto da Glutammato “caged”. Andando a stimolare le regioni selezionate (punti gialli), il Glutammato viene rilasciato e sfruttando il secondo laser è possibile registrare l’attività di calcio nei dendriti. La versatilità di FEMTO SMART permette di selezionare più aree sia in fase di stimolazione che di imaging, ma anche di concentrarsi su una regione specifica per effettuare imaging alla massima frequenza (come in questo esempio).
