A volte, per chi si approccia per la prima volta ad un Microscopio Elettronico a Scansione (SEM), magari dopo anni di utilizzo di un Microscopio Ottico, può risultare difficile immaginare e comprendere tutte le reali capacità e le possibilità di analisi di questa tecnica.
A volte, il rischio di chi illustra un SEM per la prima volta in una sessione demo o durante un corso formativo, anche solo con il buon fine di rassicurare e incoraggiare il futuro tecnico “semmista”, è di dipingere un SEM con superpoteri in grado di risolvere qualsiasi problema e di dare risposta a qualsiasi domanda.
A volte, è più facile iniziando ad ammettere ciò che non si può fare, e solo successivamente provare a spingersi oltre per trovare una soluzione che stravolga le regole o ribalti il punto di vista.
Il SEM non può dare immagini a colori (o perlomeno non colori reali!)
Le immagini SEM, sia quelle acquisite con detector di elettroni secondari (SE) sia quelle prese con detector di elettroni back-scattered (BSE), sono monocromatiche in scala di grigi, poiché le lunghezze d’onda degli elettroni sono molto più piccole di quelle della luce visibile. Le immagini SEM sono di fatto delle mappe di intensità degli elettroni raccolte dal rivelatore, in cui ogni pixel contiene solo informazioni sull’intensità intesa come numero di elettroni originariamente prodotti in quel punto e rappresentata con una tonalità di grigio che varia dal nero (nessun elettrone) al bianco (molti elettroni raccolti). Tutte le immagini SEM a colori che si possono trovare su internet sono state colorate utilizzando tecniche di post-elaborazione: è possibile ad esempio, sfruttando algoritmi di Machine Learning o AI colorare le particelle presenti in un’immagine con colori diversi a seconda della loro forma o dimensione.
Fig.1 – Immagine SEM a falsi colori acquisita con SEM Tabletop Coxem su campione di muffa (Penicillum) su pezzo di formaggio e colorata con software di elaborazione immagine.
Le mappe EDS (Energy Dispersive Spectroscopy) sono invece delle immagini SEM a cui sono state sovrapposte mappe con colori abbinati arbitrariamente a specifici elementi chimici rilevati nel campione da un detector di raggi X.
Il SEM non può fornire immagini a livello atomico e subatomico
La risoluzione del SEM, benché possa raggiungere valori intorno a 0.6 nm nei SEM FEG più performanti, non è comunque sufficiente a visualizzare un atomo, le cui dimensioni si aggirano intorno all’ ångström (0.1 nm), raggiungibile solo con un Microscopio Elettronico a Trasmissione (TEM). Inoltre, mentre il TEM può osservare la struttura interna dei campioni (inclusi ad esempio organelli e compartimenti subcellulari, fino al livello atomico), il SEM si concentra sull’analisi della superficie. Entrambe le tecniche offrono in ogni caso una risoluzione enormemente superiore rispetto ai microscopi ottici, che hanno un limite di risoluzione di circa 0.2 μm (200 nm).
Il SEM dunque non è nemmeno in grado di visualizzare direttamente come sono disposti gli atomi nello spazio in una struttura cristallina. Tuttavia, tramite la tecnica EBSD (Electron Backscatter Diffraction), grazie ad un opportuno detector che lavora in sinergia con l’EDS, si può condurre al SEM un’analisi microstrutturale grazie alla quale è possibile ottenere informazioni dettagliate sulla struttura del materiale, come l’identificazione delle fasi, le dimensioni dei grani, la loro distribuzione, le caratteristiche dei bordi e l’orientamento preferenziale (texture).
Il SEM non può vedere sotto alla superficie
Il SEM non può acquisire immagini al di sotto della superficie del campione a causa del piccolo volume di interazione tra il fascio di elettroni e il campione stesso. Per esaminare le strutture sub-superficiali o analizzare ad esempio una serie di layer depositati uno sull’altro, è necessario tagliare una sezione trasversale del campione (cross-section). Esistono diversi metodi per farlo, alcuni più grossolani, che prevedono l’uso di una troncatrice, un’inglobatrice in resina e infine una lappatrice per la lucidatura della sezione, altri invece molto più precisi che riescono a produrre una superficie a specchio che non è stata influenzata dal taglio e dalle lavorazioni successive, ma che richiedono l’utilizzo di apparecchiature più costose come l’Ion Milling o l’Ion Beam Polisher.
Fig.2 – Analisi di saldature SMT su circuiti elettronici: i pattern cristallografici ottenuti in EBSD, incrociati con i dati ottenuti in EDS, consentono di identificare inequivocabilmente le diverse fasi intermetalliche (© Oxford Instruments). Il campione è stato preparato in cross-section utilizzando la tecnica Broad Ion Beam Milling con ioni Argon (e.g. SEM Mill Modello 1061 Fischione Instruments).
Il SEM non può dare misure accurate in altezza
Il SEM non è lo strumento adatto per quantificare la rugosità superficiale su piccola scala. La microscopia a forza atomica (AFM) è la tecnica consigliata per questo scopo. Le misurazioni che coinvolgono l’altezza (asse Z) non possono essere eseguite direttamente in un SEM, tuttavia è possibile ricostruire con l’ausilio di un software di elaborazione dedicato, una visione tridimensionale a partire dalla visualizzazione bidimensionale in scala di grigi del campo di vista acquisito. Per ottenere la ricostruzione 3D a partire da immagini SEM, si può ricorrere a due diversi metodi non distruttivi che si differenziano per il numero e il tipo di immagini di partenza e per l’algoritmo di ricostruzione 3D. Il primo si basa sulla stereofotogrammetria (structure-from-motion) e consiste nel combinare due immagini dello stesso campo di vista acquisite a due diversi angoli di tilt. Il secondo invece si basa su una ricostruzione fotometrica (metodo shape-from-shading): utilizzando le immagini acquisite con ciascuno dei quattro settori del detector di elettroni retrodiffusi (BSE) è possibile derivare in maniera molto rapida la topografia tridimensionale della superficie a partire dalla diversa ombreggiatura presente in ciascuna immagine. Con questo metodo tuttavia, il calcolo delle altezze dipende da diversi parametri geometrici e di imaging e richiede pertanto una calibrazione spaziale con campioni standard dedicati.
Fig.3 – Analisi tridimensionale su rivestimento superficiale costituito da ossidi metallici di iridio e tantalio depositato su elettrodi in titanio. La ricostruzione 3D è stata ottenuta con metodo stereofotogrammetrico a partire da 2 immagini SEM acquisite a diverso angolo di tilt, e ha permesso di stimare la profondità delle crepe presenti nel coating.
Il SEM non può vedere sott’acqua
Generalmente, i SEM non vengono utilizzati per esperimenti che coinvolgono liquidi, reazioni chimiche e sistemi aria-gas, sebbene alcune camere di campionamento dedicate consentano specifiche modalità operative per questo tipo di esperimenti. L’analisi con il fascio elettronico del SEM, infatti, richiede condizioni di vuoto e i campioni non asciutti possono essere danneggiati dal vuoto a causa dell’estrazione del liquido dal campione. Anche il microscopio stesso potrebbe danneggiarsi. Nella maggior parte dei casi, i campioni naturalmente umidi devono essere seccati prima di poter essere esaminati al SEM, mentre campioni che presentano residui untuosi, ove possibile, vanno puliti ad esempio con alcool isopropilico.
Grazie a tecniche non convenzionali come la Cryo-SEM o il porta-campioni raffreddante con modulo Peltier, è tuttavia possibile congelare campioni liquidi o semisolidi per poterli osservare nella camera da vuoto del microscopio, e ampliare così le possibilità di analisi al SEM a settori come quello delle vernici, della cosmetica, dei campioni alimentari o dei campioni biologici.
Fig.4 – Studio di materiali per l’edilizia e il restauro: analisi con modulo Peltier di nanoparticelle di Ca(OH)2 in grassello di calce. Le immagini sono state acquisite con SEM tabletop Coxem.
Il SEM non può vedere ioni liberi
Il SEM non può riprodurre in modo affidabile le immagini di molecole cariche che sono mobili in una matrice. Il fascio di elettroni negativi esercita una forza elettrostatica attrattiva sul materiale carico positivamente (Legge di Coulomb). In materiali come vetri, ceramiche o campioni organici, gli ioni positivi come Na+ e Li+ possono migrare verso la superficie ed essere espulsi dal fascio elettronico, generando artefatti nell’immagine e negli spettri EDS, fenomeni di degassamento e potenziali danni al campione (degradazione e contaminazione).
La corretta identificazione di queste specie è possibile solo indirettamente attraverso tecniche di visualizzazione che evidenzino la presenza di altre sostanze ad esse legate.
Tuttavia, è possibile limitare il fenomeno di migrazione degli ioni positivi al SEM cercando di ridurre il più possibile il tempo di esposizione al fascio di elettroni e abbassando la tensione di accelerazione (kV) e la corrente del fascio. Inoltre, utilizzando la tecnica Cryo-SEM, si sfruttano le temperature criogeniche per congelare il campione e ridurre così la mobilità ionica.
Il SEM non può riconoscere con la sola sonda EDS le diverse microplastiche
Quando si parla di microplastiche spesso si fa molta confusione su cosa siano realmente le microplastiche e su come esse possano essere identificate e analizzate in maniera efficace e utile allo sviluppo delle politiche ambientali. Nonostante il termine, per microplastiche si intendono tutte quelle particelle di materiale plastico di dimensioni inferiore ai 5 mm, particelle costituite per lo più da carbonio, idrogeno e ossigeno, talvolta azoto (es: nylon e altre poliammidi), cloro (PVC), fluoro (teflon, PTFE), zolfo, ma anche da elementi provenienti da additivi inorganici presenti in minore quantità.
Per caratterizzare qualitativamente un campione eterogeneo si può ricorrere alla spettroscopia all’infrarosso (FT-IR) che però, a causa dei suoi limiti di risoluzione intrinseci, non permette di analizzare le nanoplastiche. Le immagini ad alta risoluzione e ad alto ingrandimento acquisite al SEM possono invece fornire informazioni sulla morfologia, sullo stato di invecchiamento e sull’origine dei campioni esaminati. Il detector EDS, che fornisce un’analisi elementare semiquantitativa, non è però in grado di attribuire con esattezza una microplastica ad uno specifico polimero.
Tuttavia, grazie alla RISE (Raman Imaging and Scanning Electron Microscopy), una tecnica spettroscopica correlativa Raman / SEM-EDS installabile sui SEM Ciqtek, è possibile superare il limite dell’EDS e identificare anche i composti molecolari, e dunque il tipo di polimero di cui è costituita una microplastica, con una risoluzione laterale di circa 300 nm (contro i circa 10 micron della tecnica FT-IR).
Fig.5 – Sovrapposizione delle immagini SEM e Raman (imaging iperspettrale) di una porzione di campione polimerico costituito da una miscela di PMMA (polimetilmetacrilato), in rosso, e PS (polistirene), in verde. (© Oxford Instruments)
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