La determinazione dell’EC50 (half maximal effective concentration) rappresenta un parametro fondamentale per valutare la potenza di un composto farmacologico. I metodi tradizionali si basano generalmente su saggi end-point eseguiti a tempi fissi (ad esempio 12, 24 o 48 ore) e richiedono spesso marcatori fluorescenti o reagenti chimici. Queste strategie, seppur consolidate, forniscono una visione limitata e statica della risposta cellulare e possono non rilevare effetti precoci, ritardati o transitori, riducendo l’accuratezza nella caratterizzazione dell’efficacia e della tossicità.
Una delle novità Nanolive del 2025 nasce proprio per risolvere questi problemi. Combinando le potenzialità del LIVE Cytotoxicity Assay con il nuovo universo EVE Explorer, calcolare l’EC50 non è mai stato così semplice. I software d’analisi Nanolive, assieme all’approccio label-free, introducono un sistema completamente dinamico in grado di monitorare in tempo reale la citotossicità e calcolare automaticamente l’EC50 a ogni punto temporale. Questo consente di generare curve EC50 dipendenti dal tempo, offrendo una descrizione più completa della cinetica d’azione dei farmaci a livello di singola cellula.
Figura 1: Setup sperimentale.
a. Schema del layout della piastra a 96 pozzetti che mostra cellule HeLa trattate con concentrazioni crescenti di Clorochina (da 0,1 a 1,9 μM).
b. Immagini ad alta risoluzione dell’indice di rifrazione e rispettive maschere di vitalità cellulare in cellule HeLa trattate con 1,1 μM di Clorochina ai tempi 0, 7, 17 e 44 ore.
A riprova di quanto affermato, riportiamo in questo articolo un semplice esperimento dove cellule HeLa sono state trattate con concentrazioni crescenti di Clorochina (0.1–1.9 µM) in piastra da 96 pozzetti. Le cellule sono state acquisite ogni 18 minuti per oltre 44 ore utilizzando il sistema olografico 3D Cell Explorer 96focus (Figura 1).
Le immagini sono state analizzate tramite il LIVE Cytotoxicity Assay, che sfrutta l’intelligenza artificiale per segmentare le cellule e classificare il loro stato vitale. L’unicità di questo modulo risiede nella capacità di distinguere cellule vive da cellule morte e di differenziare apoptotiche e necrotiche basandosi esclusivamente su caratteristiche morfologiche label-free. L’elaborazione dei dati è stata effettuata con NanoPlot, strumento integrato in EVE Explorer che genera automaticamente curve dose-risposta, EC50 dinamiche, visualizzazioni 2D e rappresentazioni 3D dell’evoluzione della citotossicità nel tempo.
Figura 2: Analisi dinamica dell’EC50 in cellule HeLa trattate con Clorochina.
a. Curva dose-risposta a 24 ore che mostra un EC50 calcolato di 0,5 μM.
b. Grafici EC50 generati automaticamente per ogni punto temporale da 0 a 44 ore.
c. Curve di EC50 e di EC50 assoluto dipendenti dal tempo, che riflettono la concentrazione necessaria per ridurre la vitalità del 50%.
L’imaging time-lapse ha evidenziato un chiaro incremento della morte cellulare nei campioni trattati con 1.1 µM di Clorochina, con un onset dell’effetto intorno alle 7 ore dall’esposizione. A differenza degli approcci end-point, il calcolo continuo dell’EC50 ha permesso di osservare variazioni temporali significative nella risposta al farmaco. Per esempio, l’EC50 stimato a 24 ore era pari a 0.5 µM; tuttavia, l’analisi estesa lungo l’intera durata dell’esperimento ha rivelato oscillazioni della sensibilità cellulare nell’arco di 44 ore, restituendo una curva cinetica di EC50 che non sarebbe rilevabile con un’unica misura a tempo fisso (Figura 2).
Le visualizzazioni tridimensionali (dose × tempo × frazione letale) hanno evidenziato in modo intuitivo come la tossicità si sviluppi progressivamente in funzione sia della concentrazione sia del tempo di esposizione, fornendo una mappa completa della dinamica del farmaco (Figura 3).
Figura 3: Visualizzazione 3D della cinetica della risposta al farmaco. I grafici 3D permettono il monitoraggio continuo della sensibilità cellulare alla Clorochina, offrendo una visione completa della tossicità dipendente dalla dose e della cinetica dell’effetto del farmaco, andando oltre i limiti degli esperimenti endpoint.
L’integrazione tra imaging olotomografico label-free, classificazione automatizzata della vitalità cellulare e calcolo dinamico dell’EC50 consente di superare i limiti dei saggi end-point tradizionali. Questo approccio permette di rilevare risposte cellulari complesse e non lineari, migliorando la capacità di caratterizzare l’efficacia reale dei composti e riducendo il rischio di formulare conclusioni incomplete o fuorvianti. Inoltre, la totale assenza di marcatori fluorescenti evita artefatti legati alla fototossicità o all’interferenza dei coloranti, rendendo il metodo adatto a studi long-term e/o ad alta frequenza.
L’analisi dinamica dell’EC50 resa possibile dal sistema Nanolive fornisce un quadro cinetico avanzato della risposta cellulare ai farmaci. Questo approccio rappresenta un’evoluzione significativa nel campo della valutazione preclinica della tossicità e dell’efficacia dei composti, rendendo le analisi più accurate, informative e automatizzate.
