Figura 1: All’immagine è stata applicata una maschera generata dal software d’analisi LIVE T Cell Assay, nella quale le cellule immunitarie sono segmentate e riconosciute senza necessità di marcatori a fluorescenza.
Introduzione
L’immuno-oncologia è una disciplina innovativa della medicina che sfrutta il sistema immunitario per riconoscere, attaccare e distruggere le cellule tumorali. A differenza delle terapie convenzionali, come la chemioterapia e la radioterapia che agiscono direttamente sul tumore, ma spesso colpiscono anche cellule sane, l’immunoterapia mira a potenziare le difese immunitarie del paziente per ottenere una risposta antitumorale più specifica, duratura e, in alcuni casi, curativa.
Il sistema immunitario è naturalmente in grado di identificare le cellule anomale, ma spesso, quelle cancerose sviluppano meccanismi di evasione immunitaria che impediscono al sistema immunitario di riconoscerle. L’immuno-oncologia ha come obiettivo di superare queste barriere con approcci terapeutici mirati, al fine di indirizzare le cellule del sistema immunitario a scovare, riconosce ed eliminare le cellule tumorali. Le principali strategie terapeutiche includono inibitori dei checkpoint immunitari (rimuovono i freni molecolari delle cellule T, potenziandone l’attività antitumorale), terapie con cellule T ingegnerizzate (come le CAR-T o TCR-T) e anticorpi bispecifici (che fungono da “ponte” tra cellule tumorali e cellule T, favorendo una risposta citotossica diretta). Nell’insieme, queste strategie stanno contribuendo enormemente al trattamento del cancro, portando anche a remissioni prolungate anche in pazienti con malattie avanzate (Figura 2). Tuttavia, la variabilità della risposta immunitaria tra individui e la complessità delle interazioni cellulari, rendono lo sviluppo di queste terapie molto difficile. La ricerca in questo ambito è molto attiva: numerosi ricercatori stanno concentrando i loro sforzi nella ricerca di nuovi marcatori, antigeni chimerici (CAR), anticorpi bispecifici etc, utilizzando svariate tecnologie.
Figura 2: Riassunto schematico delle attuali strategie immuno-terapeutiche.
Al fine di valutare la funzionalità di queste cellule e l’impatto di queste strategie, nelle prime fasi di ricerca e Sviluppo numerose tecnologie vengono utilizzate. Un diagramma riassuntivo delle tecnologie disponibili e comunemente utilizzate in questo settore è disponibile in figura 3. In tabella è possibile notare come la maggior parte degli approcci forniscono numerosi parametri, ma sono end-point assay, ovvero test che implicano la terminazione dell’esperimento per effettuare l’analisi. Di conseguenza, esperimenti come Flow Cytometry, Affinity & Binding Assays e Molecular Biology Techniques, non forniscono dati riguardo le interazioni e dinamiche cellulari real-time. Per visualizzare le cellule in time-lapse è possibile effettuare live-cell imaging con fluorescenza, tuttavia, l’utilizzo di marcatori e sonde comporta una quasi inevitabile alterazione del campione, dovuta alla fototossicità. Infine, anche se limiti minori, la maggior parte di queste tecnologie non sono automatizzate e non forniscono software d’analisi, rendendo output e quantificazione aspetti limitanti, laboriosi e poco riproducibili.
In questo contesto, Nanolive si afferma come un’importante soluzione tecnologica nel campo dell’immunoterapia. Nel 2021 Nanolive ha rilasciato il LIVE T Cell Assay (LTCA), il primo ed unico software al mondo in grado di riconoscere cellule immunitarie e tumorali senza l’utilizzo di marcatori a fluorescenza. Grazie all’imaging olotomografico e all’intelligenza artificiale, LTCA consente di segmentare e distinguere co-colture cellulari, fornendo una descrizione dettagliata delle interazioni tra le due (o più) popolazioni e una caratterizzazione funzionale più rapida, quantitativa e non invasiva delle immunoterapie. Recentemente Nanolive ha rilasciato una nuova versione di LTCA, la quale introduce importanti novità e nuovi parametri d’analisi dedicati alle co-colture immuno-oncologiche. In questa application note, descriveremo 3 case studies analizzati con Nanolive e LTCA in modo da assaporare tutte le potenzialità di questo incredibile software d’analisi.
Figura 3: Tabella riassuntiva delle varie tecnologie disponibili per valutare approcci immunoterapeutici.
Flow-Cytometry: tecnologia che fornisce numerosi parametri a livello di single-cell, ma rimane un approccio end-point, pertanto non può fornire informazioni sulle dinamiche cellulari real-time.
Fluorescence Live-Cell Imaging: questo approccio riesce a fornire informazioni sulle dinamiche cellulari e subcellulari real-time, ma richiede l’utilizzo di marcatori fluorescenti e dunque introduce inevitabilmente fototossicità e può alterare i risultati.
Affinity & Binding Assay: questi test forniscono informazioni riguardo l’affinità e efficienza dei legami di anticopri o cellule, ma non riguardo la cellula e suo fenotipo.
Molecular Biology Assays: le tecniche di biologia molecolare tradizionali sono tutte end-point assay, pertanto non possono fornire informazioni riguardo le dinamiche e interazioni cellulari nel tempo.
Nanolive LTCA: live-imaging label-free e analisi guidate dall’intelligenza artificiale rendono questo approccio il più efficace in termini di readout funzionali, dettagli sub-cellulari e dinamiche cellulari, ma soprattutto come user-friendliness e riproducibilità.
L’olotomografia di Nanolive
Uno degli strumenti più rivoluzionari nella ricerca è senza dubbio il 3D Cell Explorer di Nanolive, primo microscopio olotomografico al mondo in grado di visualizzare cellule vive in 3D e in time-lapse senza l’utilizzo di marcatori fluorescenti. L’assenza di fluorescenza elimina totalmente tutti i problemi legati alla fototossicità, rendendo Nanolive un microscopio perfettamente adatto ad esperimenti di live-imaging con ogni tipo di coltura cellulare. Nanolive genera immagini ad alta risoluzione spaziale, permettendo l’imaging di dettagli subcellulari, e ad alta risoluzione temporale, permettendo la registrazione di eventi e dinamiche cellulari in real-time. L’alta risoluzione assieme all’imaging label-free, rendono Nanolive un approccio perfetto per osservare le interazioni tra co-colture di cellule immunitarie e tumorali.
La magia del modulo d’analisi LIVE T Cell Assay
I video generati dai microscopi Nanolive affascinano per la loro qualità e per la capacità di mostrare la vita cellulare in modo unico e suggestivo. Tuttavia, nella ricerca scientifica non basta la bellezza delle immagini: servono dati concreti e risultati misurabili. Per questo Nanolive ha sviluppato una suite di software avanzati che, grazie all’intelligenza artificiale, trasformano i video olotomografici in analisi quantitative con un solo click. Il software di base EVE Analytics (EA) fornisce già una descrizione completa del campione, restituendo informazioni dettagliate su tre livelli: popolazione, morfologia e contenuto cellulare. A potenziare ulteriormente questa piattaforma vi sono i Digital Assays, moduli dedicati ad applicazioni specifiche che, partendo dalle metriche di EA, aggiungono nuovi parametri per l’analisi approfondita di processi biologici mirati. Tra i più innovativi, il LIVE T Cell Assay (LTCA), rilasciato nel 2021, rappresenta oggi un punto di riferimento nell’ambito dell’immuno-oncologia. Questo Digital Assay consente infatti di studiare in modo label-free le interazioni tra cellule immunitarie e tumorali, distinguendole e fornendo metriche e statistiche precise sui contatti, le connessioni e i fenomeni di citotossicità (Figura 4A e B). Nello specifico, LTCA fornisce, oltre ai parametri base di morfologia, contenuto e popolazione cellulare, metriche come (1) numero di T Cell in contatto con Target Cell, (2) percentuale dell’area delle Target Cell coperta dall’area delle T Cell e viceversa, (3) velocità media delle T Cell e (4) distanza minima media tra popolazione T Cell e Target Cell. In altre parole, LTCA consente di misurare in maniera oggettiva e dettagliata le interazioni tra cellule immunitarie e tumorali, identificando eventuali segnali di stress o morte cellulare indotti dall’attività citotossica delle T Cell (Figura 4B). Per un ulteriore approfondimento, è possibile consultare un nostro precedente articolo tecnico dedicato a questo software, collegandosi a questo link: LTCA.
Figura 4: A. Tabella riassuntiva delle immagini olotomografiche ottenibili con Nanolive e rispettive maschere generate dall’AI di LTCA. Questo modulo d’analisi è in grado di distinguere le due popolazioni cellulari, sia tumorali che immunitarie, per poi classificarle: rosse immunitarie, blu tumorali, mentre in giallo, le immunitarie in contatto con le tumorali. B. Una volta classificate le due popolazioni, LTCA integra queste informazioni con le metriche calcolate da EA ottenendo dati sul “Finding”, “Binding”, “Stressing” e “Killing”.
Come anticipato nell’introduzione, nel 2025 Nanolive ha ulteriormente potenziato questa tecnologia, introducendo una nuova generazione di LTCA arricchita da funzionalità inedite che ampliano ancora di più le possibilità di analisi. La prima incredibile novità, è la compatibilità di LTCA con qualsiasi tipologia di campioni tumorali, sia solidi che liquidi. Se la prima generazione distingueva “solamente” colture tumorali in adesione, la Next-Gen LTCA riconosce senza errori anche i campioni tumorali liquidi (Figura 5). Le novità non sono finite qui: nei prossimi paragrafi descriveremo 3 Case Study in modo da apprezzare le nuove capacità del Next-Gen LTCA.
Figura 5: Con la Next-Gen LTCA è possibile distinguere colture tumorali in adesione e non, rispetto alle cellule immunitarie. Questa novità apre nuove possibilità d’analisi con qualsiasi tipologia di campione
Case Study 1 – Valutazione dell’efficacia delle CAR-T
Lo sviluppo di terapie CAR-T richiede un’attenta selezione dei cloni più efficaci nel riconoscere e eliminare le cellule tumorali. L’approccio tradizionale prevede numerosi passaggi, dal design del recettore chimerico (CAR) alla modifica genetica delle T Cell, fino alla fase di espansione e validazione preclinica (Figura 6). In questa fase, identificare precocemente i cloni più promettenti è cruciale per accelerare lo sviluppo terapeutico e ridurre i costi di ricerca.
Figura 6: Workflow per selezione dei cloni CAR-T più efficaci. Il recettore chimerico (CAR) viene sviluppato e trasdotto nella popolazione di T Cell, precedentemente isolata e coltivata. Ottenute le CAR-T cell, vengono testate e solo i migliori candidati procedono con i test in vivo e successivamente clinical trial. In questo case study, Nanolive è stato utilizzato per valutare l’efficacia di vari cloni CAR-T.
In questo studio, quattro cloni di CAR-T sono stati messi in co-coltura con cellule tumorali pancreatiche (rapporto 500:200) e monitorati in modalità label-free per 14 ore, con acquisizioni ogni 6 minuti. Terminato l’esperimento, è stato sufficiente premere un singolo click per lanciare l’analisi LTCA sui quattro video ottenuti, generando automaticamente un set completo di parametri quantitativi. I risultati sono stati organizzati in tre categorie chiave, ovvero attivazione delle T Cell, interazioni con le cellule tumorali e vitalità delle cellule Target (Tumorali) (Figura 7).
Figura 7.1: Co-colture di CAR-T cell e cellule tumorali pancreatiche analizzate con LTCA. Nello specifico l’analisi applicata si concentra sulla popolazione dello stato delle cellule immunitarie. Questa grande novità del Next-Gen LTCA consente di definire e quantificare il numero di cellule CAR-T attive, inattive e morte. La maschera generata (e applicata al video olotomografico) è molto intuitiva e definisce le cellule attive in azzurro, inattive in blu e morte in arancione. Nella piccola leggenda in alto a sinistra è possibile notare la color map, ma anche la morfologia che contraddistingue le tre categorie.
In questo esperimento i 4 cloni mostrano differenti comportamenti: mentre il clone CAR-T-2 si dimostra il clone più attivo, la popolazione del clone CAR-T-3 rimane perlopiù inattiva. Infine, il clone CAR-T-1 mostra una maggiore mortalità rispetto agli altri, mentre il clone CAR-T-4 non mostra pattern significativi.
Figura 7.2: Co-colture di CAR-T cell e cellule tumorali pancreatiche analizzate con LTCA. Nello specifico l’analisi applicata si concentra sulle interazioni tra le due popolazioni. La classificazione già menzionata in precedenza riporta le cellule immunitarie in rosso, tumorali in blu e i punti di contatto in giallo.
La percentuale di CAR-T in contatto con le tumorali è riportata nel grafico e mostra come il clone CAR-T-3 inizialmente effettua molte connessioni, ma cala col passare del tempo. Ciò è coerente con l’inattivazione crescente osservata nell’analisi precedente. Il clone CAR-T-2 mostra una maggiore percentuale di contatti rispetto agli altri 2 cloni (-1 e -4).
Figura 7.3: Co-colture di CAR-T cell e cellule tumorali pancreatiche analizzate con LTCA. Nello specifico l’analisi applicata si concentra sulla mortalità della popolazione tumorale. La maschera applicata è descritta in alto a sinistra, dove le cellule vive vengono colorate digitalmente in verde e quelle morte in arancione. Il clone che induce più morte cellulare è il CAR-T-1, seguito da CAR-T-2, -4 e -3.
Figura 7.4: Tabella riassuntiva delle performance di ogni clone CAR-T. Questa analisi ha permesso di distinguere in modo chiaro le performance dei quattro cloni: CAR-T-1 ha mostrato un’elevata aggressività ma scarsa vitalità, mentre CAR-T-2 ha combinato una forte attività citotossica con una buona persistenza. Al contrario, CAR-T-3 ha stabilito numerosi contatti ma con limitata efficacia, mentre CAR-T-4 si è rivelato attivo ma con impatto ridotto su tutti i parametri.
Alla luce di queste analisi, possiamo affermare che LTCA consente di effettuare in maniera immediata uno screening funzionale dettagliato e label-free, supportando decisioni rapide e data-driven nella selezione dei cloni CAR-T migliori per le fasi successive dello sviluppo.
Case Study 2 – Analisi della specificità delle CAR-T
Un aspetto cruciale delle terapie CAR-T non è soltanto l’efficacia, ma anche la specificità: un clone poco selettivo può infatti riconoscere epitopi simili e attivare reazioni off-target con conseguenze potenzialmente gravi. Fortunatamente, l’imaging label-free di Nanolive consente di monitorare le interazioni nel tempo e valutare quantitativamente la specificità dei legami effettuati dai vari cloni di CAR-T. Come nel Case Study precedente, il protocollo di selezione coinvolge più passaggi, ma in questo paragrafo ci concentreremo sulla valutazione della specificità (Figura 8).
Figura 8: Workflow per selezione dei cloni CAR-T più efficaci. Il recettore chimerico (CAR) viene sviluppato e trasdotto nella popolazione di T Cell, precedentemente isolata e coltivata. Ottenute le CAR-T cell, vengono testate e solo i migliori candidati procedono con i test in vivo e successivamente clinical trial. In questo case study, Nanolive è stato utilizzato per valutare la specificità di vari cloni CAR-T.
In questo esperimento, un clone CAR-T è stato messo in co-coltura con cellule tumorali polmonari umane ingegnerizzate per esprimere quattro differenti epitopi (ovvero molecole di membrana riconosciute dalla CAR-T cell). Oltre all’epitopo in analisi (ovvero l’antigene che le CAR-T sono state sviluppate per riconoscere), denominato Epitopo A, una seconda popolazione tumorale è stata ingegnerizzata per esprimere un epitopo “errato”, off-target denominato Epitopo X. Per completezza, altre due popolazioni tumorali sono state modificate per esprimere varianti modificate dell’epitopo A e X: queste varianti rappresentano eventuali mutazioni o tumor-escape variant.
Le co-colture sono state monitorate per 4 ore con acquisizioni ogni 7 minuti e analizzate con LTCA. I readout selezionati hanno incluso: attivazione delle CAR-T, interazioni con le cellule bersaglio e stato di vitalità delle cellule tumorali (Figura 9).
Figura 9.1: Co-colture di CAR-T cell e cellule tumorali polmonari analizzate con LTCA. Nello specifico l’analisi applicata si concentra sulla vitalità e moralità della popolazione tumorale. Le CAR-T mostrano un’elevata aggressività quando esposte all’epitopo A e alla sua variante. Viceversa, il campione con l’epitopo off-target e la sua variante mostrano bassi livelli di affinità
Figura 9.2: Co-colture di CAR-T cell e cellule tumorali polmonari analizzate con LTCA. Nello specifico l’analisi applicata si concentra sull’attivazione della popolazione immunitaria. Le CAR-T mostrano una grande attivazione quando esposte all’epitopo A e alla sua variante, mentre rimangono maggiormente inattive se esposte all’epitopo X e sua variante. Questi risultati dimostrano un’elevata specificità da parte delle CAR-T verso l’epitopo A ed eventuali varianti.
Figura 9.3: Tabella riassuntiva delle analisi effettuate con LTCA nel case study 2. Le CAR-T cell hanno mostrato elevata specificità verso l’epitopo A e questa caratteristica è mantenuta anche verso la sua variante mutata. Al contrario, l’epitopo X e la sua variante modificata non hanno indotto nessuna attivazione o citotossicità delle CAR-T confermando l’assenza di effetti off-target.
L’analisi ha mostrato come il clone testato riconoscesse in modo altamente selettivo l’epitopo A, con minima reattività sugli epitopi non specifici. In altre parole, LTCA ha permesso di discriminare in maniera rapida e quantitativa il profilo di specificità del clone, riducendo il rischio di effetti off-target e fornendo dati solidi per la validazione preclinica (Figura 9).
In conclusione, la capacità di quantificare in real-time le interazioni cellula-cellula senza marcatori consente di valutare la sicurezza e specificità delle CAR-T già in fase di screening, anticipando criticità che emergerebbero solo in vivo. Il tutto, con un unico esperimento e con un semplice click.
Case Study 3 – Performance dei Bispecific Antibodies
Gli anticorpi bispecifici (bsAbs) rappresentano un’innovativa strategia immunoterapica in grado di fungere da “ponte” tra cellule T e cellule tumorali, facilitando il riconoscimento e l’eliminazione del bersaglio. Valutarne l’efficacia richiede un’analisi dettagliata non solo delle interazioni, ma anche della vitalità delle cellule tumorali e del comportamento dinamico delle T Cell. Il protocollo per la selezione di bsAbs inizia con l’identificazione di un target e successivo design dell’anticorpo (Figura 10). Una volta ottenuto il bsAbs si passa subito alla fase di valutazione in vitro dove ne viene testata l’efficacia. I canditati più promettenti verranno poi ottimizzati a livello di potenza, stabilità e produzione, per poi passare a test in vivo e successivamente ai clinical trial.
Figura 10: Workflow di sviluppo e validazione degli anticorpi bispecifici (bsAbs). Dopo la fase iniziale di identificazione del target e design dell’anticorpo, i candidati vengono sottoposti a screening in vitro per valutarne specificità, funzione e affinità. I migliori candidati proseguono nella fase di ottimizzazione e caratterizzazione, seguita da test in vivo. Solo i lead più promettenti entrano infine nella fase di sviluppo clinico.
In questo esperimento, due anticorpi bispecifici candidati sono stati messi in co-coltura con cellule T e cellule tumorali pancreatiche. Come controllo sono stati inclusi altri due anticorpi, uno positivo (notoriamente funzionante) e uno negativo (incapace di legare le due popolazioni cellulari). Grazie alla tecnologia non invasiva di Nanolive, le co-colture sono state monitorate per ben 72 ore consecutive, con acquisizioni ogni 8 minuti.
La successiva analisi con LTCA ha permesso di ottenere una visione completa delle performance: frequenza e durata dei contatti tra T Cell e cellule tumorali, variazioni morfologiche delle cellule bersaglio, velocità e attività delle T Cell. Questo approccio ha evidenziato differenze sostanziali tra i candidati, consentendo di selezionare rapidamente gli anticorpi con il miglior bilancio tra potenza, specificità e sicurezza (Figura 11).
Figura 11.1: Co-colture di T-cell e cellule tumorali pancreatiche trattate con bsAbs e analizzate con LTCA. Nello specifico l’analisi applicata si concentra sulle interazioni tra le due popolazioni. Infatti, per valutare l’efficacia dei bsAbs, è importante quantificare il numero di contatti tra T-cell e cellule tumorali. A differenza del controllo negativo, le popolazioni di T-cell in presenza dei 2 bsAbs e del bsAbs positivo effettuano numerosi contatti con la popolazione tumorale.
Figura 11.2: Co-colture di T-cell e cellule tumorali pancreatiche trattate con bsAbs e analizzate con LTCA. Nello specifico l’analisi applicata si concentra sull’attivazione delle cellule T, e la loro area e velocità. Entrambi i bsAbs candidati e il controllo positivo inducono un’attivazione marcata delle cellule T, dunque non solo mettono in contatto le due tipologie cellulari, ma inducono una risposta funzionale. La maggior attivazione è confermata anche dall’incremento dell’area media delle T cell, la quale rimane invariata nel controllo negativo. Infine, l’aumento della mobilità completa il quadro, confermando che i 2 bsAbs in analisi (e il controllo positivo) promuovo l’attivazione della popolazione immunitaria.
Figura 11.3: Co-colture di T-cell e cellule tumorali pancreatiche trattate con bsAbs e analizzate con LTCA. Nello specifico l’analisi applicata si concentra sugli effetti citotossici delle T-cell indotti dai bsAbs. Entrambi i bsAbs in analisi si dimostrano molto efficaci mostrando un’elevata citotossicità (fino all’80%) a confronto del controllo negativo. Importante notare come il bsAbs 2 abbia prestazioni migliori rispetto al bsAbs 1.
Figure 11.4: Tabella riassuntiva delle analisi effettuate con LTCA sulle prestazioni dei 4 bsAbs. Entrambi i candidati mostrano prestazioni convincenti, pari a quelle del controllo positivo. Tuttavia, il bsAbs 2 induce una risposta citotossica più velocemente rispetto al bsAbs 1.
Grazie a questo Case Study è possibile apprezzare come l’integrazione dell’imaging label-free e dell’analisi AI-driven trasformi la valutazione dei bsAbs in un processo altamente automatizzato, riducendo i tempi di screening e aumentando la riproducibilità dei dati.
Conclusioni
L’immunoterapia rappresenta una delle sfide più promettenti e al tempo stesso complesse della medicina moderna. Lo sviluppo di terapie come le CAR-T e gli anticorpi bispecifici richiede strumenti capaci di andare oltre gli approcci tradizionali, fornendo dati funzionali, quantitativi e realmente predittivi in tempi rapidi.
In questa Application Note abbiamo mostrato come la combinazione dell’olotomografia e del software LTCA di Nanolive offra una soluzione unica per studiare in modo non invasiva le interazioni tra cellule immunitarie e tumorali. Grazie ad un workflow estremamente semplice e a parametri avanzati, LTCA consente di valutare simultaneamente efficacia, specificità e sicurezza delle nuove strategie immunoterapeutiche, riducendo al minimo tempi, costi e variabilità sperimentale.
In definitiva, l’approccio proposto da Nanolive accelera e rende più affidabile il percorso che porta dall’idea terapeutica alla validazione preclinica, supportando ricercatori e aziende biotech nel portare più velocemente al paziente la prossima generazione di terapie immuno-oncologiche.