Microscopi Elettronici “Cryo”, sia a scansione (SEM) che a trasmissione (TEM), sono ampiamente utilizzati per la caratterizzazione di campioni biologici o di altri materiali con un elevato contenuto di acqua.
Con questo termine in realtà si possono intendere due diverse tipologie di analisi a bassa temperatura, una è la tecnica Cryo-EM vera e propria, mentre l’altra si avvale di un particolare stage portacampioni da utilizzare per le analisi con un SEM tradizionale.
Fig. 1 – Immagini acquisite con Cryo-SEM Ciqtek su campioni di foglia di frutto di bosco (A), yogurt (B) e muffa (C).
La principale differenza sta nel fatto che la Cryo-SEM/TEM (Scanning/Transmission Electron Cryomicroscopy) identifica una tecnica, un sistema completo per preparare e fare imaging su campioni a temperature criogeniche (tipicamente inferiori a -140°C), mentre un Cooling Stage basato su cella di Peltier è un componente che può essere montato all’interno di qualsiasi SEM (anche tabletop) e che può essere utilizzato per un raffreddamento più moderato (tipicamente fino a -50°C o in rari casi fino a -75°C, a seconda del modello), e rappresenta dunque un metodo di congelamento meno estremo (e meno costoso) per l’osservazione al SEM.
La tecnica Cryo-SEM impiega generalmente azoto liquido per congelare rapidamente il campione in un modulo esterno in bagno di azoto liquido: la crio-fissazione blocca i processi metabolici e preserva le strutture biologiche nei campioni prima dell’analisi al microscopio elettronico, evitando la formazione di cristalli di ghiaccio che potrebbero danneggiare le strutture cellulari. Successivamente in una precamera dedicata è possibile preparare film sottili o superfici di frattura a partire dal campione congelato e applicare un rivestimento conduttivo mediante Ion Beam Sputtering. Il campione viene mantenuto in vuoto criogenico anche all’interno del modulo di trasferimento e così pure durante l’osservazione all’interno della camera del SEM, dove è alloggiato su un cryo-stage raffreddato ad azoto liquido.
Fig. 2 – Sistema Cryo-SEM Ciqtek costituito da 5 moduli: modulo di crio-fissazione, camera di preparazione del campione, modulo di trasporto, interfaccia SEM, e cryo-stage raffreddato ad azoto liquido.
La cella raffreddante per effetto Peltier, invece, è in grado di controllare la temperatura del campione solo all’interno della camera del SEM, attraverso un particolare portacampioni collegato ad una flangia che permette di introdurre nella camera da vuoto le connessioni elettriche e i tubi per l’acqua. La cella di Peltier è fondamentalmente una pompa di calore a stato solido dall’aspetto di una piastrina sottile, in cui una delle due superfici assorbe il calore mentre l’altra lo emette, per effetto di una corrente continua applicata ai capi della piastrina stessa. Il funzionamento della cella all’interno del SEM si basa sulla sottrazione di calore dal campione mediante adesione del lato freddo al campione stesso; la sottrazione di calore è favorita dalla creazione di opportuni ponti termici (adesivi termoconduttivi, in rame o in grafite) che permettano al meglio la conduzione. Il calore sottratto è trasferito sul lato caldo, dove deve essere asportato verso l’ambiente esterno, in genere sfruttando il passaggio di acqua in un circuito chiuso alimentato da una piccola unità refrigerante (chiller) esterna.
Fig. 3 – Sistema Cooling Stage Coxem per SEM tabletop, costituito da chiller refrigerante (1), controller di temperatura (5), portacampioni con cella Peltier e flangia di connessione al SEM (7).
Le principali differenze tra le due metodologie di analisi SEM a bassa temperatura sono riassunte nella tabella di Fig.4.
Fig. 4 – Tabella di confronto tra l’accessorio Cooling Stage basato su cella Peltier e la tecnica Cryo-SEM (La tabella è stata generata con AI Overview di Google).
