Qualche mese fa abbiamo parlato di Aurox Clarity come soluzione low-cost per dare una seconda vita a microscopi widefield inutilizzati o fuori uso (Clarity Solution). Oggi, abbiamo deciso di mostrarvi più nel dettaglio le performance di questo strumento proponendovi un’analisi della risoluzione e super-risoluzione ottenibile con Clarity.
Come descritto nell’articolo precedente, Clarity è un add-on compatibile con tutti i microscopi a fluorescenza che permette la trasformazione di un sistema widefield in un confocale spinning disk senza l’implementazione di laser. Grazie all’illuminazione strutturata, questo strumento è in grado di ottenere immagini con una risoluzione superiore ai limiti del microscopio preesistente. La configurazione ottimale di Clarity è rappresentata in figura 1 ed è composta da una lightsource LED (CoolLED pe-300), una camera CMOS (Hamamatsu ORCA-Flash 4.0 V3) e gli opportuni filtri per fluorescenza (Figura 1). In questo esperimento, tale set-up è stato installato su un microscopio invertito Nikon Ti-E dotato di un obiettivo 63x (1.4 NA oil immersion). Come campione invece, sono stati utilizzati fibroblasti murini NIH3T3, fissati su slide di vetro e marcati per alpha-tubulina (con anticorpo secondario 488).
Per valutare l’upgrade di risoluzione prodotto da Clarity, lo stesso field of view è stato acquisito in 3 modalità: widefield, spinning disk e super-resolution. L’immagine widefield è stata ottenuta utilizzando Clarity grazie alla possibilità di spegnere lo spinning disk (dunque utilizzando lo stativo Nikon, ma lightsource, filtri e camera di Clarity) e con un tempo di esposizione di 200ms. Riattivando poi lo spinning disk, è stata ottenuta una singola immagine confocale con 0.9um di sectioning e 200ms di esposizione. Infine, utilizzando gli stessi settaggi, una serie di 100 immagini confocali è stata acquisita automaticamente attraverso il software Visionary (programma di acquisizione di Aurox).
Al fine di ottenere l’immagine confocale in super-risoluzione, i 100 frame sono stati analizzati con il plug-in open-source di ImageJ, SFFR (Super-Resolution Radial Fluctuations) applicando i parametri di default. Le 3 tipologie di immagine sono poi state comparate attraverso la generazione di un profile plot di una linea tracciata arbitrariamente su un dettaglio cellulare.
Analizzando i profile plots ottenuti, ma anche osservando direttamente le immagini acquisite, è evidente che l’installazione di Clarity porti ad un netto miglioramento della qualità d’immagine. La rimozione del segnale out-of-focus dovuta all’inserimento dello spinning disk nel cammino ottico risulta in un miglior contrasto e definizione dei dettagli. Inoltre, la risoluzione è ulteriormente migliorabile applicando il plug-in SRRF, dimostrando che è possibile ottenere una super-risoluzione anche senza costosi e complicati sistemi di microscopia confocale a laser.
