Protocolli di preparativa campione a confronto.
Il microscopio elettronica a trasmissione (TEM) è uno strumento fondamentale per studiare l’ultrastruttura dei campioni biologici. Il protocollo di lavoro standard per l’imaging di questi campioni, rimasto pressoché invariato da oltre 50 anni, prevede l’uso di microscopi ad alta tensione (HV-TEM, ≥80 kV) combinati con un protocollo di preparativa che comprende soluzioni a base di metalli pesanti, in particolare l’acetato di uranile (UA), per migliorare il contrasto delle immagini. Tuttavia, questo approccio presenta limiti significativi: costi elevati, infrastrutture complesse, tossicità e natura radiogena dell’uranile.
In questo breve articolo verrà proposto come la Microscopia Elettronica a Bassa Tensione (LVEM, ~25 kV) possa essere un’alternativa più sicura ed economica. A basse tensioni, l’interazione degli elettroni con il campione aumenta, producendo un contrasto naturalmente più elevato, fino a venti volte superiore rispetto ai 100 kV.
Sono stati testati quattro diversi protocolli di preparazione su macrofagi (linea RAW 264.7) esposti a virus, variando la presenza o assenza di uranile acetato nelle fasi di staining “en bloc” e post-staining. Le immagini ottenute con LVEM sono state confrontate con quelle ottenute con un High Voltage – TEM (80 kV).
Dopo la crescita overnight, le cellule sono fissate con una soluzione di paraformaldeide al 2,5% e glutaraldeide al 2% e successivamente, trattate con glicina 50 mM per bloccare i gruppi aldeidici residui.
Successivamente alla fissazione delle cellule, si è passati a stabilizzare i lipidi di membrana e ad aumentare la densità elettronica ai campioni. Per questa fase, di “post-fissazione” sono stati utilizzati due approcci.
- OsO₄ al 1%: post-fissazione standard con tetrossido di osmio in tampone PIPES per un’ora a temperatura ambiente.
- OsO₄ al 1% + C6FeK4N6 al 0,75%: detto anche “osmio ridotto”, questa combinazione migliora selettivamente il contrasto delle membrane cellulari rispetto alla sola soluzione di osmio.
Successivamente, vediamo ora la colorazione “en bloc” con acetato di uranile. La colorazione “en bloc” (letteralmente “in blocco”) viene eseguita sull’intero campione ancora in forma di pellet cellulare, prima dell’inclusione in resina. Nello studio da cui questo articolo è tratto, è stata utilizzata una soluzione di uranile acetato all’1% in acqua per un’ora. L’uranile acetato è un sale di uranio che si lega elettrostaticamente agli acidi nucleici e ai fosfolipidi delle membrane, aumentandone la densità elettronica e quindi il contrasto nelle immagini TEM. Questa fase è stata deliberatamente omessa in alcuni campioni per valutarne l’impatto sull’immagine finale.
Dopo la colorazione en bloc, i campioni vengono disidratati in una serie graduata di etanolo (30%, 50%, 70%, 90%, 100%) e acetone, quindi infiltrati con resina Spurr e polimerizzati a 60°C overnight.
I blocchi di resina vengono sezionati, producendo sezioni ultrasottili di circa 70 nm, e raccolte su griglie da TEM.
L’ultimo step del protocollo di preparativa è quello del “post-staining”.
La post-colorazione viene eseguita direttamente sulle sezioni già depositate sulle griglie TEM, dopo il sezionamento. In questo studio la post-colorazione prevede una doppia sequenza:
- Uranile acetato allo 0,5% in acqua: agisce sugli acidi nucleici e le membrane, aumentando il contrasto generale della sezione.
- Citrato di piombo al 3%: si lega alle strutture ricche di osmio (membrane, ribosomi, glicogeno), amplificando ulteriormente il contrasto. Il piombo reagisce con l’osmio già presente nel campione, rendendo visibili dettagli fini della struttura cellulare.
Anche questa fase viene omessa in alcuni campioni come controllo sperimentale, per valutare quanto contribuisca alla qualità finale dell’immagine rispetto alla sola colorazione en bloc o alla sola post-fissazione con osmio.
I quattro metodi a confronto
Lo studio confronta sistematicamente quattro combinazioni di protocolli, ciascuna testata con e senza post-staining finale (UA + citrato di piombo):
Tabella 1: schema riassuntivo delle metodologie analizzate
Il Metodo I rappresenta il protocollo più semplificato, completamente privo di uranile, utile per valutare quanto contrasto sia ottenibile con il solo osmio e l’LVEM. Il Metodo IV è il più completo, combinando osmio ridotto, uranile en bloc e post-colorazione, avvicinandosi al protocollo tradizionale ma con la flessibilità di poter omettere la post-colorazione
I campioni derivati da questi quattro metodi sono stati poi analizzati in parallelo con il microscopio LVEM 25E di Delong Instruments (operato a 25 kV) e con un sistema tradizionale ad alto voltaggio (HV-TEM) operato a 80 kV.
In figura 1 è possibile osservare i risultati ottenuti su campioni preparati con le 4 metodologie, a basso (A) ed alto (B) ingrandimento utilizzando LVEM Delong a 25kV. Con tutti i protocolli, la ridotta tensione di accelerazione si è dimostrata idonea alla visualizzazione delle ultrastrutture cellulari grazie ad un’ottima resa di contrasto.
Figura 1: Low (A) e High (B) ingrandimento di campioni di macrofagi preparati con diversi protocolli (Methods I, II, III, IV). Immagini acquisite con LVEM25E di Delong Instruments a 25kV.
Figura 2: Immagini di macrofagi preparati con diversi protocolli. Acquisite con TEM tradizionale ad alto voltaggio (80kV).
Il confronto quantitativo tra LVEM e HV-TEM (Figura 2) sui campioni non colorati (Metodo I) rende la differenza difficilmente ignorabile. Il rapporto segnale/rumore (SNR) misurato con LVEM raggiunge un valore di 8,08, contro uno scarso 0,99 dell’HV-TEM tradizionale a 80 kV (Figura 3).
Figura 3: Profilo contrasto in immagini di macrofagi senza staining (Method I) acquisite a 25kV e 80kV
Analogamente, il rapporto contrasto/rumore (CNR) si attesta a 4,60 per l’LVEM rispetto a soli 0,80 per l’HV-TEM. In termini pratici, questo significa che il sistema a bassa tensione riesce a distinguere strutture cellulari che risultano praticamente invisibili con l’approccio convenzionale quando l’uranile viene rimosso dal protocollo.
Un ulteriore elemento di distinzione emerso dal confronto tra i metodi riguarda la fase di post-fissazione. L’utilizzo dell’osmio ridotto (Metodi III e IV) ha fornito un contrasto delle membrane cellulari visibilmente superiore rispetto alla sola post-fissazione con OsO₄ (Metodi I e II). Questo effetto è particolarmente evidente nelle immagini ad alta magnificazione, dove la nitidezza dei doppi strati lipidici risulta determinante per l’interpretazione dell’ultrastruttura.
Nel complesso, i dati raccolti disegnano uno scenario in cui la microscopia a bassa tensione non è semplicemente un’alternativa economica all’HV-TEM, ma uno strumento con caratteristiche proprie che, in specifici contesti applicativi, può superare le prestazioni del sistema tradizionale soprattutto quando si punta a semplificare i protocolli, ridurre l’uso di sostanze tossiche e rendere la Bio-TEM accessibile a una platea più ampia di laboratori e centri di ricerca.
